Монастырь был основан пришедшим из Новгородской земли иноком Феодором и присоединившимся к нему позднее Павлом по благословению Сергия Радонежского в 1363 году. Согласно «Повести о Борисоглебском монастыре», Сергий Радонежский сам выбрал место для обители. Основатели монастыря прославлены как преподобные и входят в Собор Ростово-Ярославских святых. Их погребение находится в северо-западном углу Борисоглебского собора и служит местом почитания этих святых. Особую известность получил преподобный Иринарх Затворник, живший в монастыре в конце XVI — начале XVII веков. Его мощи под спудом сберегаются в паперти соборного храма монастыря. Согласно житию святого, у него в 1612 году получили благословение на защиту Москвы от поляков князь Дмитрий Пожарский и нижегородский посадский человек Кузьма Минин. Среди церковных деятелей, подвизавшихся в Ростовском Борисоглебском монастыре, — архиепископ Ростовский и Ярославский Тихон (Малышкин). Настоятелем монастыря уже в Новое время некоторое время являлся археограф и палеограф, собиратель и исследователь памятников древнерусской письменности Амфилохий (Сергиевский-Казанцев), будущий епископ Угличский. Монастырь стал духовным и экономическим центром, вокруг которого возникли Борисоглебские слободы — крупное торговое село Ростовского уезда Ярославской губернии, центр Борисоглебской волости. В 1764 году слободы из владения монастыря были переданы Екатериной II ее фавориту графу Григорию Орлову. В дни памяти святых Бориса и Глеба у стен монастыря традиционно проходила богатая ярмарка.